De genomische sequenties van de meeste virussen zijn bekend.Nucleïnezuurprobes die korte DNA-segmenten zijn die zijn ontworpen om te hybridiseren met complementaire virale DNA- of RNA-segmenten.De polymerasekettingreactie (PCR) is een efficiëntere techniek voor virale detectie.Diagnostische methoden met hoge doorvoer zijn recentelijk ontwikkeld.
A. Nucleïnezuurhybridisatietechniek
Nucleïnezuurhybridisatie, voornamelijk met inbegrip van Southern blotting (Southern) en Northern blotting (Northern), is een zich snel ontwikkelende nieuwe techniek op het gebied van virusdiagnose.De grondgedachte van de hybridisatietest is het gebruik van korte DNA-segmenten (genaamd "probe") die zijn ontworpen om te hybridiseren met complementaire virale DNA- of RNA-segmenten.Door verhitting of alkalische behandeling worden dubbelstrengs doelwit-DNA of -RNA gescheiden in enkele strengen en vervolgens geïmmobiliseerd op een vaste drager.Daarna wordt de probe toegevoegd en gehybridiseerd met het doelwit-DNA of -RNA.Omdat de sonde is gelabeld met isotoop of niet-radioactief nuclide, kan het doel-DNA of -RNA worden gedetecteerd door autoradiografie of door het biotine-avidinesysteem.Aangezien de meeste virale genomen zijn gekloond en gesequenced, kunnen ze worden gedetecteerd met behulp van virusspecifieke sequenties als probes in het monster.Momenteel omvatten de hybridisatiemethoden: dot-blot, in situ-hybridisatie in cellen, DNA-blotting (DNA) (Southern-blot) en RNA-blotting (RNA) (Northern-blot).
B.PCR-technologie
In de afgelopen jaren is een reeks in vitro nucleïnezuuramplificatietechnieken ontwikkeld op basis van PCR, om ongevoelige of oncultiveerbare virussen te testen.PCR is een methode die specifieke DNA-sequenties kan synthetiseren door in vitro polymerasereactie.Het proces van PCR omvat een thermische cyclus van drie stappen: denaturatie, annealing en verlenging. Bij hoge temperatuur (93℃~95℃), wordt het dubbelstrengs DNA gescheiden in twee enkele DNA-strengen;vervolgens bij lage temperatuur (37℃~60℃) hechten twee gesynthetiseerde nucleotideprimers aan de complementaire DNA-segmenten;terwijl bij de juiste temperatuur voor het Taq-enzym (72 ), de synthese van nieuwe DNA-ketens begint vanaf het 3'-uiteinde van de primer met behulp van complementair DNA als templates en enkele nucleotiden als materialen.Dus na elke cyclus kan één DNA-keten worden geamplificeerd tot twee ketens.Door dit proces te herhalen, kan elke DNA-keten die in één cyclus is gesynthetiseerd, worden gebruikt als matrijs in de volgende cyclus, en het aantal DNA-ketens wordt in elke cyclus verdubbeld, wat betekent dat de productie van PCR wordt geamplificeerd met een snelheid van 2 n log.Na 25 tot 30 cycli wordt de productie van PCR geïdentificeerd door middel van elektroforese en kunnen de specifieke DNA-producten worden waargenomen onder UV-licht (254 nm).Vanwege het voordeel van specificiteit, gevoeligheid en gemak is PCR toegepast bij de klinische diagnose van veel virale infecties zoals HCV, HIV, CMV en HPV.Omdat PCR erg gevoelig is en virus-DNA op fg-niveau kan detecteren, moet de operatie zeer zorgvuldig worden uitgevoerd om valse positieven te voorkomen.Bovendien betekent een positief resultaat in de nucleïnezuurtest niet dat er een levend infectieus virus in het monster zit.
Met brede toepassing van PCR-techniek, worden nieuwe technieken en methoden ontwikkeld op basis van PCR-techniek voor verschillende testdoeleinden.De realtime kwantitatieve PCR kan bijvoorbeeld virale lading detecteren;in situ PCR wordt gebruikt om virusinfectie in weefsel of cellen te identificeren;De geneste PCR kan de specificiteit van PCR verhogen.Onder hen is real-time kwantitatieve PCR sneller ontwikkeld.Veel nieuwe technieken, zoals TaqMan-hydrolysesonde, hybridisatiesonde en moleculaire bakensonde, zijn gecombineerd tot realtime kwantitatieve PCR-techniek, die veel wordt gebruikt in klinisch onderzoek.Naast het nauwkeurig identificeren van de virale lading in het lichaamsvocht van patiënten, kan deze methode ook worden gebruikt om medicijntolerante mutanten op te sporen.Daarom wordt realtime kwantitatieve PCR voornamelijk toegepast bij de evaluatie van curatieve effecten en het toezicht op de tolerantie van geneesmiddelen.
C. High-throughput detectie van virale nucleïnezuren
Om te voldoen aan de behoefte aan snelle diagnose van nieuwe opkomende infectieziekten, zijn er verschillende high-throughput detectiemethoden ontwikkeld, zoals DNA-chips (DNA).Voor DNA-chips worden specifieke probes gesynthetiseerd en bevestigd aan kleine siliciumchips in zeer hoge dichtheid om DNA-probe-microarray (DNA) te vormen die met het monster kan worden gehybridiseerd.Het signaal van hybridisatie kan worden afgebeeld met een confocale microscoop of laserscanner en verder worden verwerkt door de computer en er kan een enorme dataset over verschillende genen worden verkregen.Er zijn twee soorten DNA-chips.De “synthesechip” ziet er als volgt uit: de specifieke oligonucleotiden worden direct op de chips gesynthetiseerd.Een andere is de DNA-poolchip.De gekloonde genen of PCR-producten worden geordend op het glaasje afgedrukt.Het voordeel van DNA-chiptechnologie is de gelijktijdige detectie van een enorme hoeveelheid DNA-sequenties.De nieuwste versie van de pathogeendetectiechip kan meer dan 1700 menselijke virussen tegelijk identificeren.DNA-chiptechnologie loste de problemen van traditionele nucleïnezuurhybridisatiemethoden op en heeft zeer brede toepassingen in virale diagnose en epidemiologisch onderzoek.
Posttijd: 23-dec-2020